【目的】研究 ClO?處理對厚皮甜瓜果實(shí)采后愈傷的影響為厚皮甜瓜的采后愈傷提供方法和理論依據。

【方法】以‘瑪瑙’厚皮甜瓜為試材，人工模擬損傷后，用25 mg/L的ClO?浸泡損傷果實(shí) 10min，于常溫黑暗條件下進(jìn)行愈傷。測定愈傷期間損傷果實(shí)的失重率以及損傷接種粉紅單端孢果實(shí)的病情指數，通過(guò)甲苯胺藍和間苯三酚—鹽酸染色法觀(guān)察聚酚軟木脂、聚酯軟木脂和木質(zhì)素在傷口部位的積累，并用 IS Capture 圖像軟件對聚酚軟木脂、聚酯軟木脂和木質(zhì)素積累量進(jìn)行分析。測定傷口表面的色度值，分析傷口處組織愈傷期間苯丙烷代謝活性以及過(guò)氧化物酶和多酚氧化酶的活性變化。

【結果】ClO?處理顯著(zhù)降低了損傷果實(shí)的失重率和損傷接種果實(shí)的病情指數，愈傷第7天時(shí)，處理比對照低10.3%。果實(shí)在損傷后不同時(shí)間段接種粉紅單端孢，經(jīng)1周培養觀(guān)察，處理果實(shí)的病情指數顯著(zhù)低于對照，第7 天時(shí)處理果實(shí)的病情指數比對照低 56.9%。處理顯著(zhù)促進(jìn)了果實(shí)傷口處聚酚軟木脂、聚酯軟木脂和木質(zhì)素的積累，處理果實(shí)的積累量在愈傷的中后期顯著(zhù)高于對照，三者比對照分別高25.3%、77.7%和35.5%。愈傷期間，處理果實(shí)傷口處的L*值顯著(zhù)低于對照，b*值顯著(zhù)高于對照，在愈傷第5 天時(shí)，處理果實(shí)的L*值比對照低6.1%，第3天時(shí)的b*值比對照高17.8%。處理明顯提高了果實(shí)傷口處的苯丙氨酸解氨酶、過(guò)氧化物酶和多酚氧化酶活性，在愈傷第7天時(shí)，處理果實(shí)傷口處的苯丙氨酸解氨酶、過(guò)氧化物酶和多酚氧化酶活性分別高于對照 34.3%、80.5%和 15.7%。此外，處理果實(shí)傷口處的總酚、類(lèi)黃酮和木質(zhì)素含量也顯著(zhù)高于對照，第7天時(shí)，分別高于對照14.7%、16.8%和 15.6%。

【結論】ClO?處理可有效促進(jìn)厚皮甜瓜果實(shí)的采后愈傷，ClO?對愈傷的促進(jìn)作用與激活傷口處的苯丙烷代謝，提高POD和PPO活性，促進(jìn)軟木脂和木質(zhì)素的積累密切相關(guān)。

       【研究意義】厚皮甜瓜(Cucumis melonL.) 是我國西北地區特色水果，由于果實(shí)個(gè)體較大，在采收和采后過(guò)程中易受機械損傷，機械損傷造成的表面傷口為病原物的侵染提供了通道，加劇了采后腐爛的發(fā)生。因此，有效降低傷口性病原菌的侵染率是采后厚皮甜瓜亟待解決的問(wèn)題。前人研究進(jìn)展不同果實(shí)表面形成的傷口具有不同程度的愈合能力，通過(guò)在傷口部位積累軟木脂和木質(zhì)素等具有保護作用的天然聚合物，從而抑制傷口部位水分的大量蒸騰，阻止病原物經(jīng)由傷口的侵入。近期研究發(fā)現，某些化學(xué)藥物還具有促進(jìn)傷口愈合的作用。例如，苯丙噻重氮可以促進(jìn)采后梨果實(shí)的愈傷，脫落酸能提高采后番茄和獼猴桃果實(shí)的愈傷能力。ClO?可殺滅病原物，對果蔬風(fēng)味和品質(zhì)無(wú)明顯影響。有報道表明，ClO?處理可減輕龍眼和番茄果實(shí)的采后病害，延緩蘋(píng)果成熟衰老，減輕采后腐爛。還可一定程度上抑制鮮切哈密瓜的后熟。而 ClO?在減輕采后病害中的作用與增強果實(shí)苯丙烷代謝和提高氧化酶活性密切相關(guān)。

【本研究切入點(diǎn)】雖然已有 ClO?誘導采后果實(shí)抗病性的報道，但該化合物是否影響厚皮甜瓜果實(shí)采后愈傷尚未見(jiàn)報道。擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題本研究以“瑪瑙”厚皮甜瓜果實(shí)為試材，用 ClO?處理人工損傷的果實(shí)后在常溫條件下進(jìn)行愈傷，測定愈傷期間損傷果實(shí)的失重率以及接種果實(shí)的病情指數，觀(guān)察愈傷組織的色度以及聚酚軟木脂、聚酯軟木脂和木質(zhì)素的積累變化。分析氧化酶和苯丙烷代謝關(guān)鍵酶活性及其代謝產(chǎn)物的含量。評價(jià) ClO?處理對厚皮甜瓜果實(shí)采后愈傷能力的影響，為ClO?處理在厚皮甜瓜的采后應用提供方法和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

供試‘瑪瑙’甜瓜于2017年7月采自甘肅省民勤縣收成鄉露地大田，選取八成熟、外觀(guān)整齊、大小一致、無(wú)病蟲(chóng)傷和機械傷的果實(shí)，單果套網(wǎng)套后裝入瓦楞紙包裝箱，于當天運抵本實(shí)驗室, 在常溫下 (20~25℃, RH70-80%) 貯藏待用。

粉紅單端孢(Trichothecium roseum) 為甘肅厚皮甜瓜產(chǎn)區最常見(jiàn)的采后病原真菌,由本實(shí)驗室提供，于PDA培養基上保存待用。

ClO?有效濃度120mg/g，于4℃冰箱保存。

刮皮刀；恒溫培養箱; 超凈工作臺；立式壓力蒸汽滅菌鍋; 正置萬(wàn)能顯微鏡;Ci6x分光光度儀； 臺式高速冷凍離心機; 紫外-可見(jiàn)光分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 果實(shí)人工損傷及愈傷

參照姜紅等的方法并進(jìn)行修改。果實(shí)先用清水沖洗，然后用1%的次氯酸鈉浸泡1min 進(jìn)行表面消毒，再用無(wú)菌水沖洗，晾干后用刮皮刀在果實(shí)的赤道部位分別刮出4條長(cháng)30mm、寬30 mm、深2mm 的傷口。在室溫條件下暴露0.5 h后,將損傷的果實(shí)浸入25 mg/L的ClO?浸泡10min,取出晾干后分別裝入打孔的聚乙烯保鮮袋(25cm×40cm,厚度0.02mm),于常溫、避光條件下進(jìn)行愈傷，以清水處理作對照。每處理用果實(shí)120個(gè)，重復3次。

1.2.2 愈傷效果的評價(jià)

1.2.2.1 失重率及病情指數的測定

失重率的測定采用重量法。每處理用果實(shí)9個(gè)，重復3次。

病情指數的測定參照姜紅等的方法并修改。在培養了1 周的T.roseum培養皿中加入一定量的無(wú)菌水，用涂布器刮下孢子用4層紗布過(guò)濾至錐形瓶中，在振蕩器上振蕩15 s，經(jīng)過(guò)血球計數板計數配置成濃度為 1×10?個(gè)/mL 的孢子懸浮液。分別在果實(shí)損傷后的第0、1、3、5、7天，用涂布器將20μL配好的孢子懸浮液均勻涂于創(chuàng )口表面，晾干后裝入打孔的聚乙烯保鮮袋中，常溫培養7天后統計病情指數。每個(gè)處理用果實(shí)8個(gè)，重復3次。病情指數- ∑(高痔物口傷口個(gè)數x態(tài)減病吸別)×100式中，發(fā)病級別的標準為：4級，創(chuàng )口表面全部發(fā)??；3級，創(chuàng )口表面 3/4 的面積發(fā)??；2級，創(chuàng )口表面1/2面積發(fā)??；1級，創(chuàng )口表面 1/4 面積發(fā)??；0級，創(chuàng )口表面不發(fā)病。

1.2.2.2 聚酚軟木脂、聚酯軟木脂和木質(zhì)素沉積的觀(guān)察

聚酚軟木脂(suberin poly phenolic, SPP) 和聚酯軟木脂(suberin poly aliphatic,SPA)的沉積觀(guān)察參照ILulai的方法并修改。用不銹鋼刀片垂直傷口表面切成厚0.2~0.3 mm，長(cháng)和寬各為1 cm左右的薄片。采用如下步驟進(jìn)行染色：用0.1%小檗堿(0.05%甲苯胺藍)染色45 min后, 先吸去染料, 再用蒸餾水和 75%酒精洗2~3 遍, 最后用 95%酒精洗 1~2遍，即脫去染料，緊接著(zhù)在0.25%甲苯胺藍(1%中性紅)中放置1~2m in進(jìn)行復染，最后用蒸餾水和 75%酒精洗去染料，SPP(SPA)即染為紫藍色。將染好色的薄片置于載玻片上，在顯微鏡下熒光觀(guān)察拍照。每個(gè)果實(shí)切片4處，重復3次。

木質(zhì)素的沉積觀(guān)察參照ALBA 等的方法并修改。用不銹鋼刀片垂直傷口表面切成厚0.2~0.3mm,長(cháng)和寬各為1cm左右的薄片, 滴加1%間苯三酚染色1.5min后再加1~2滴濃鹽酸，木質(zhì)素即染為紅色，置于顯微鏡下觀(guān)察拍照。每個(gè)果實(shí)切片4處，重復3次。

愈傷組織的SPP、SPA 和木質(zhì)化細胞層的厚度根據文獻的方法通過(guò)IS Capture 圖像軟件進(jìn)行測量計算。

1.2.3 愈傷組織色度的測定

在愈傷的0、1、3、5、7 d用Ci6x 分光光度儀垂直于愈傷組織表面進(jìn)行色度的測定，依次測定 L*、a*和b*值，每個(gè)處理測 12處愈傷組織。

1.2.4 生化測定取樣

參照BI等的方法。在愈傷的0、1、3、5、7d，用不銹鋼刀片垂直傷口表面下取2~3mm深的傷口組織3g，用錫箔紙包好后用液氮冷凍，在-80℃超低溫冰箱中保存備用。

1.2.5 苯丙氨酸解氨酶、過(guò)氧化物酶和多酚氧化酶的活性測定

苯丙氨酸解氨酶(phenylalnine ammonialyase,PAL)的測定參照 Liu等的方法并修改。取冷凍樣品3g, 于5mL 硼酸-硼砂緩沖液(pH8.8, 含40g/L 聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone, PVP), 2 mmol·L?1乙二胺四乙酸 (ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) 和5 mmol·L?1β-巰基乙醇) 中冰浴研磨成漿, 在4℃、12 000×g條件下離心30 min, 上層酶液即為粗酶液。反應體系包括: 0.1mL 粗酶液, 3mL 硼酸-硼砂緩沖溶液液 (50mmol/L,pH8.8), 0.5mL食物L(fēng)-苯丙氨酸(20mmol/L), 以蒸餾水為參比, 測定反應體系混合10s 后在290 nm波長(cháng)處的吸光值作為初始值(OD?)，將混合液在37℃水浴鍋中保溫1 h后在 290 nm波長(cháng)處的吸光值作為終止值(OD?)。以每小時(shí)吸光值變化值增加0.01 為一個(gè)酶活性單位 (U), 以U/g FW表示。

過(guò)氧化物酶(peroxidase,POD) 和多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO) 的測定參照Li的方法。取冷凍樣品3g, 于5mL 乙酸-乙酸鈉緩沖液((pH5.5, 含 1mmol/L 聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG),4%交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(crosslinking polyvingypyrrolidone,PVPP) 和1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)) 中研磨成漿, 在4℃、12 000×g條件下離心 30min, 收集上層液用即為粗酶液。POD反應體系: 3mL25mmol/L 愈創(chuàng )木酚, 0.1mL 酶提取液, 0.2mLH?O?(5mmol/L)。以蒸餾水為參比, 在反應進(jìn)行到15s時(shí)測定混合液在470nm波長(cháng)處的吸光值2min。以每分鐘吸光值變化值增加1為一個(gè)酶活性單位(U)，以U/gFW 表示,重復3次。PPO反應體系:4mL 乙酸-乙酸鈉緩沖液(50mmol/L,pH5.5),lmL 鄰苯二酚溶液(50mmol/L), 0.1mL 酶提取液。以蒸餾水為參比, 在反應進(jìn)行到15s 時(shí)測定混合液在420nm波長(cháng)處的吸光值2min。以每分鐘吸光值變化值增加1為一個(gè)酶活性單位 (U), 以U/mg FW表示。

1.2.6 總酚、類(lèi)黃酮和木質(zhì)素的含量測定

總酚和類(lèi)黃酮的測定參照Pirie 等的方法并作修改。取冷凍樣品3g，于預冷的4mL HCL-甲醇溶液中冰浴研磨成漿，在4℃避光條件提取20min，期間搖動(dòng)數次過(guò)濾收集上層清液待用。以 1%HCL-甲醇溶液做為參比，分別測定濾液在280nm和325nm波長(cháng)處的吸光度值作為總酚和類(lèi)黃酮的含量，分別以OD280·g?1FW 和(  表示。木質(zhì)素的含量測定參照Yan等的方法進(jìn)行測定。取冷凍樣品3g，于預冷5mL95%乙醇中研磨成漿，在4℃, 14000×g條件下離心30min, 棄去上清液, 將沉淀物依次用95%乙醇, 乙醇(V):正己烷(V)=1：2沖洗3次，將清洗后的沉淀物在60℃烘箱中干燥24 h后轉移至離心管中,溶于1mL25%溴化乙酰冰醋酸溶液,70℃恒溫水浴30min后加入1mL NaOH(2mol/L)終止反應。最后加入2mL冰醋酸和0.1mL鹽酸羥胺(7.5mol/L), 在4℃、12000×g條件下離心 30 min, 取上清液0.5mL并用冰醋酸定容至5mL, 在280nm波長(cháng)處測定吸光值。

1.3 數據統計

上述測定均重復3次。全部數據用Excel 2010計算平均值和標準誤(±SE),用SPSS 19.0進(jìn)行 Duncan’s 多重差異顯著(zhù)性分析及相關(guān)性分析 (P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 ClO?處理對愈傷期間果實(shí)失重率和病情指數的影響

愈傷期間，處理和對照果實(shí)的失重率均逐漸升高，但處理果實(shí)的失重率顯著(zhù)低于對照，第 7 天時(shí),比對照低 10.3%(P<0.05)(圖 1-A)。處理和對照果實(shí)的病情指數均隨愈傷時(shí)間的延長(cháng)逐漸下降，處理果實(shí)顯著(zhù)低于對照，第7天時(shí)，僅相當于對照的43.1%(P<0.05)

愈傷期間，處理和對照果實(shí)傷口處的SPP 和SPA積累量均逐漸增加，處理果實(shí)的積累量在愈傷的中后期均顯著(zhù)高于對照(圖2-A，B)。SPP和SPA的積累差異分別始于第1天和第3天, 第7 天時(shí) SPP 和 SPA 的積累厚度分別比對照高25.3%和        

處理和對照果實(shí)傷口處的木質(zhì)素積累始于愈傷中期。在第7天時(shí)，處理果實(shí)木質(zhì)素的積累厚度比對照高 35.5%(P<0.05)(圖 3-C)。SPP、SPA 和木質(zhì)素的積累結果表明, 有效促進(jìn)了厚皮甜瓜果實(shí)傷口處的木栓化。

愈傷期間，處理和對照果實(shí)傷口處的L*值均先上升后下降，在愈傷的后期顯著(zhù)低于對照, 第5天和第7天時(shí),分別比同期對照低6.1%和5.8%(P<0.05)(圖4-A)。處理和對照果實(shí)的a*值差異不顯著(zhù)(結果未顯示)。兩者b*值總體先降后升，在愈傷的前期和中期顯著(zhù)高于對照。第3天時(shí), 比對照高17.8%(P<0.05)。

處理對傷口處PAL、POD和 PPO活性以及總酚、類(lèi)黃酮、木質(zhì)素含量的影響

愈傷期間，處理和對照果實(shí)傷口處的 PAL 活性均逐漸升高，但處理果實(shí)的 PAL 活性顯著(zhù)高于對照, 第7天時(shí), 比對照高34.3%(P<0.05)(圖5-A)。對照果實(shí)的POD和PPO 活性隨愈傷時(shí)間的延長(cháng)逐漸升高，而處理果實(shí)的活性則先略有降低后顯著(zhù)升高，在愈傷的后期顯著(zhù)高于對照,第7天時(shí), POD 和 PPO 活性分別比對照高80.5%和15.7%(P<0.05)(圖 5-B，C)。處理果實(shí)傷口處的總酚、類(lèi)黃酮和木質(zhì)素含量在愈傷期間均呈先降后升的趨勢,在愈傷的后期顯著(zhù)高于對照。第7天時(shí),分別比對照高14.7%、16.8%和15.6%(P<0.05)(圖5-D, E, F)。PAL、POD 和 PPO 活性以及總酚、類(lèi)黃酮和木質(zhì)素含量的增加結果表明,  激活了厚皮甜瓜果實(shí)傷口處的苯丙烷代謝以及氧化酶活性。

3 討論

ClO?可通過(guò)增強苯丙烷代謝和提高氧化酶活性來(lái)誘導果實(shí)的采后抗病性。本研究發(fā)現，ClO?處理可通過(guò)激活采后厚皮甜瓜果實(shí)傷口處的苯丙烷代謝及氧化酶活性，加速軟木脂和木質(zhì)素在傷口處的沉積，從而促進(jìn)了厚皮甜瓜果實(shí)的采后愈傷。

本研究發(fā)現，ClO?處理可顯著(zhù)提高厚皮甜瓜果實(shí)傷口處的PPO活性。處理果實(shí)傷口處L*值高于對照，b*值低于對照的結果表明，PPO參與了愈傷組織的形成，處理果實(shí)傷口處的L*值在0 d 顯著(zhù)高于對照可能源于 ClO?的漂白作用。在愈傷中由于細胞內膜被破壞，液泡中的酚類(lèi)底物會(huì )和PPO發(fā)生反應，氧化為醌，醌再進(jìn)一步聚合為黑色或褐色的物質(zhì)。這些聚合物不僅引起果實(shí)組織褐變，而且可直接抑制病原菌生長(cháng)，鈍化病原菌分泌的胞外酶，該結果與 Wei等人在獼猴桃愈傷期間觀(guān)察到的結果一致。

4 結論

ClO?采后處理可有效降低損傷果實(shí)的失重率和損傷接種果實(shí)的病情指數，促進(jìn)了厚皮甜瓜的采后愈傷。ClO?處理對采后厚皮甜瓜愈傷的促進(jìn)作用與激活果實(shí)苯丙烷代謝，提高POD和PPO活性，促進(jìn)SPP、SPA和木質(zhì)素在傷口處的積累密切相關(guān)。